中国科学家利用CRISPR/Cas9 技术基因编辑人类胚胎引争议

2001年，人类基因组工作草图发表，成为破译人类遗传信息的重要里程碑。雄心勃勃的人类基因组计划，与曼哈顿原子弹计划、阿波罗登月计划一起，并称为人类自然科学史上的三大计划。与前两个计划不同，人类基因组计划研究重点从制造原子弹和探索外太空转向了探究人类自身。当今的生物科技，特别是基因测试和DNA测序，已经产生了一系列急需讨论的生物伦理学议题。从克隆羊多利，到基因筛选，再到无癌宝宝，定制婴儿，科学的进步不断冲击人类的认知边界和道德底线。随着医学的进步，“设计婴儿”或21世纪版的优生学已引起科学家们的广泛关注。科学家认为通过调节人类基因组可以得到基因改造的完美婴儿。牛津大学人类未来研究院院长、哲学教授尼克·博斯特罗姆(Nick Bostrom)在其新书《超级智能》(Super Intelligence)中认为，基因是创造超级智商人类的关键。科学家预测未来人类可能拥有类似超人的认知能力：“人类将立刻具有天才般的能力、近乎完美的图像和语言能力、超快的思维和推理能力、强大的几何可视化能力、甚至更高的维度、执行多项分析或训练平行想象能力等。”

自从染色体在生命中所起的重要作用被发现以来，科学家们都一直梦想能够通过直接编辑基因进而从根本上治疗疾病。人体内已命名的基因共有25000多条，目前已知一部分基因（3000）的突变会引起各类疾病。对于此类疾病的治疗，最本质的手段是通过一些方法将突变后的遗传物质矫正回原来的状态。这类方法被称为遗传疗法（genetic therapies）。目前最广泛的遗传疗法手段为：1. 以病毒载体感染方式引导的源基因导入；2. 以RNA干扰方式引导的目的基因表达下调。基因编辑技术（genome editing technologies）是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，在疾病治疗方面的应用模式主要为：矫正/沉默有害突变，插入保护性突变，加入治疗性基因以及敲除病毒DNA。北海道大学的Tetsuya Ishii去年发表综述指出，近年来飞速发展的基因编辑技术（主要是CRISPR）非常简单，很容易在生殖诊所中使用。Ishii最担心的是美国和中国。生殖细胞基因编辑在美国并没有被禁止，只是需要政府批准。中国虽然有相关禁令但执行起来可能并不容易，比如说用超声鉴定性别就没有完全被控制住。而且中国的灵长类基因编辑发展得最为迅速。
目前，基因组编辑有三大技术：CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN。ZFN，TALEN以及CRISPR/cas9核酸内切酶均能够特异性地识别与切割特定的DNA序列，引起DNA双链断裂（DSB）。CRISPR-Cas9基因组编辑技术是基于原核生物内源性的免疫反应。当原核生物遇到外源的核酸比如病毒基因组或者质粒的时候，一些原核生物把一部分很短的外源序列整合到自己的一个或者多个CRISPR位点，接着CRISPR位点被转录加工生成CRISPR RNAs (crRNAs)。crRNA接着会引导DNA剪切酶Cas9根据序列互补的原则剪切未来入侵的外源核酸序列。此外CRISPR-Cas9还能精确地在指定位点引入外源核酸序列， 与传统的TALEN和ZFN技术相比，CRISPR/Cas9系统更便捷、高效，应用也更广泛，目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确修饰。目前已发现三种不同类型的 CRISPR/Cas系统，存在于大约40%和90%已测序的细菌和古菌中。其中第二型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心的组成。由于其对DNA干扰(DNAi)的特性，目前被积极地应用于遗传工程中，作为基因体剪辑工具。

由于CRISPR/Cas技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑，为构建更高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台，受到众多科学家的追捧。2006年的诺贝尔奖获得者Craig Mello在接受美国国家公共电台采访时对CRISPR/Cas9赞不绝口；此外，在Cell杂志盘点的2013年度最佳论文中，CRISPR/Cas9也荣登榜单。一场围绕CRISPR-Cas9的专利大战也随之打响了，两个团队分别号称自己最先发明了这项技术。来自加州伯克利大学的Jennifer Doudna教授和德国亥姆霍兹医学研究中心的Emmanuelle Charpentier教授领导的合作小组最先在《科学》杂志上报道了利用CRISPR-Cas9进行基因组编辑的技术。他们正在申请一项专利，包含了该项技术在不同种类细胞中的大量应用的155项声明，同时他们声称该专利的优先日期是2012年5月25号。而来自麻省理工（MIT）的张锋小组也利用CRISPR-Cas9在真核生物上进行了基因组编辑,张峰也申请了专利，专利的优先日期是在2012年12月12号，更为重要的是，专利已经被批准发行了。 此后，和CRISPR-Cas9相关的专利如同雨后春笋般冒了出来，仅张锋这一个团队就已经获批了8项专利，都是通过"快速通道"获批，广泛涵盖了该项技术的各种应用。有些专利更是指向某些特定应用，比如有一项专利是专门针对CRISPR-Cas9技术在治疗亨廷顿舞蹈病上的应用。

用CRISPR技术编辑人类胚胎有多容易呢？“任何掌握分子生物学技术和胚胎发育知识的科学家都能完成这项工作，”曾于2012年参与发现用CRISPR技术编辑基因的生物学家Jennifer Doudna说。哈佛医学院George Church的实验室里研究人员正在赋予大肠杆菌一些自然界从没有见过的基因。年轻的博士后Luhan Yang是一个来自北京的年轻人，是编辑CRISPR-Cas9基因技术的重要参与者。Yang和Church一起创办了一家小公司，从事猪和牛的基因改造，加入优良基因，去掉劣质基因。号称聚集了众多世界一流生殖学博士的OvaScience生物技术公司也在致力于这方面的研究。这些研究团队的目标是，阐明有可能使儿童没有某些特定的会引起遗传病的基因。如果有可能纠正女性卵细胞或男性精子中的DNA，就可以在体外受精中用这样的生殖细胞生成一个胚胎，然后发育成一个婴儿。也有可能用CRISPR技术直接编辑早期发育阶段的体外受精胚胎的DNA。《MIT技术评论》采访的几位科学家说，在中国已经在进行这样的实验了，介绍基因改造后的胚胎发育状况的文章也即将发表。这些人不愿意公开自己的身份，因为这些文章还正在审核之中。这一切都意味着，生殖细胞基因改造研究的进展已经超过了所有人的想象。

Salk研究所的发育生物学家Juan Carlos Izpisua Belmonte正在用基因编辑技术去除线粒体的致病突变，他的研究对象是未受精的卵子。未来，经过线粒体修饰的人类卵子可能会用于IVF试管婴儿，防止后代从母亲那里遗传到线粒体疾病。近期MIT Technology review发表了一篇新闻报道，讨论了哈佛大学George Church实验室中中国留学生杨璐涵关于利用Cas9技术编辑人类生殖细胞的问题，文章发表之后获得广泛关注。杨璐涵作为第一作者在Nature Communication上发表Targeted and genome-wide sequencing reveal single nucleotide variations impacting specificity of Cas9 in human stem cells文章中阐明了可以通过对个人进行全基因组的深度测序分析从而进行更加个性化的Cas9位点设计，从而运用CRISPR技术的精确度。2015年4月中山大学基因工程教育部重点实验室研究人员在Protein&Cell发表了他们的课题组利用CRISPR/Cas9系统对人类胚胎基因组改造的研究结果，有传言表示，目前中国至少有4个课题组在进行相关人类胚胎的研究，其中至少一个课题组在用正常人类胚胎或近似正常的人类胚胎进行研究。这一次的转基因人类胚胎研究，必将再次引发一段时间的争论。

中山大学的研究人员利用了一种“不能存活”的受精卵来进行研究。这种受精卵含有一个卵细胞和两个精子的三个细胞核，从而不能正常发育成婴儿。研究人员利用最近很火的CRISPR/Cas9系统来剪切受精卵中人的HBB基因（β-globin gene），因为HBB基因突变会导致β地中海贫血症。他们注射了86个三核受精卵，其中71个受精卵存活。在做检测的54个样品中，有28个受精卵的HBB被剪切了，而其中只有更小一部分被重组修饰了。不仅如此，非靶向的突变也出现了。研究人员就认为目前这种技术在胚胎上应用的效率太低太不成熟了。非靶向突变的出现也说明这一技术存在一定的问题，因为这些非靶向的突变通常都是有害的，如果做全基因组测序会发现更多的非靶向基因被修饰了。如果想在医学上应用CRISPR/Cas9技术，还需要改进该技术的准确性和保真性。研究人员计划利用成体细胞或者动物模型来继续研究，通过不同的策略来减少非靶向突变，另外也可以考虑其他基因编辑技术，比如TALEN技术。

这篇文章被Nature和Science拒稿的部分原因都是伦理问题。生殖细胞基因编辑（改造胚胎、卵子或精子）一直是人们关注的额角点，因为这样的遗传学改变会代代相传影响后代。一些人认为基因编辑胚胎研究具有光明的未来，因为它能在孩子出生之前来消除严重的遗传性疾病。而另一些人认为这种研究跨越了伦理底线，因为这种胚胎修饰是可遗传的，可能会对未来带来意想不到的后果。还有人担心，因为这种技术的简单易操作，会有人进行不安全或者不道德的应用。美国再生医学联盟的主席Edward Lanphier联合四位学者在三月十二日的Nature杂志上发表评论“不要编辑人类生殖细胞”。文章号召研究者们暂时不要对人类生殖细胞进行基因编辑。因为用现有技术对人类胚胎进行基因编辑，可能对后代产生无法预测的后果。“这样的技术可能被利用，进行非治疗性的基因编辑。我们担心这样的伦理问题会引起公众抗议，影响基因编辑技术在医疗领域的美好前景”“我们需要停下任何涉及人类胚胎的生殖细胞基因编辑”

CRISPR/Cas9技术的发明人之一加州大学的生化学家Jennifer Doudna也和其他作者一起发文呼吁全球应该暂停这种技术的应用，从而给科学家，伦理学家和大众时间来了解。Jennifer Doudna认为，基因编辑技术在医疗上的每一个应用，都需要分别验证其安全性和有效性。2015年1月，20多位科学家、伦理学家和法律专家来到了加州的Napa谷，在葡萄园里度假。他们是发现了如何用CRISPR技术编辑基因的伯克利科学家Doudna召集来的。她已经意识到，也开始担忧，有些科学家会迫不及待地用这种方法来对生殖细胞进行基因改造。现在她想知道，他们是否可以停止。Doudna说，“作为科学家，我们都知道CRISPR技术非常强大。但是事情都有两面性。我们必须确保它能够得到谨慎的应用。在应用于人类生殖细胞编辑的时候尤其要注意。”在1975年的Asilomar会议上，生物学家就如何安全地处理重组的DNA达成了共识。那么在Napa的这次聚会中Doudna也希望如此。Doudna认为，不仅应该暂停关于改造胚胎的研究，还应该暂停利用CRISPR技术改变人类精子和卵子的研究。她说，“我认为这样的实验是不恰当的。我觉得现在需要的研究是了解这种技术的安全性、有效性和有关分娩的知识。我认为可以在人类以外的动物身上进行这样的实验。”

21世纪人类最大威胁-自助式人体克隆 （DIY Cloning）

有人说，世界上最具破坏力的是DNA。现在最流行DIY（即自己动手），年轻人中流行起了自助式人体克隆 （DIY Cloning）。微软创始人比尔·盖茨去年接受《连线》月刊采访时说，如果他现在十三四岁，他“要做生物黑客，用合成DNA的方式创造人造生命”。他说：“如果你想彻底改变世界，就应该从生物分子开始做起。”生物黑客，又称生物崩客（biohack），自己动手的生物学家，车库生物学家（garage biologist）等，是为了防止出现技术被少数专业人士所掌握而形成的垄断操纵而产生的一群团体。他们主要是通过网络及其他手段来普及现代生物学知识。平时他们可能以智库成员的身份出现在自己的工作单位，业余时间则按自己的理想或幻想搞生物实验。美国有许多生物学的网络开放平台。在平台上，基因专家和爱好者可以亲密交流，分享彼此的心得和成就。只要对生物学有想法，并愿意自学，任何人都可以利用平台上的资源。

最具革命意义的计算机硬件和软件创新中，大部分都是来自车库。比尔·休利特（Bill Hewlett）和戴维·帕卡德（Dave Packard）（比尔·休利特和戴维·帕卡德是惠普公司的创始人。——译者注） 正是在车库里酝酿他们的资讯技术业巨擘。史蒂夫·乔布斯（Steve Jobs）和史蒂夫·沃兹尼亚克（Steve Wozniak）在20世纪70年代时，组装出了第一台苹果电脑，他俩是居家计算机俱乐部里最早的黑客成员。谢尔盖·布林（Sergey Brin）和拉里·佩奇（Larry Page）的谷歌公司也是诞生于朋友家的车库里。马克·扎克伯格（Mark Zuckerberg）则是在自己的宿舍里搞出了Facebook。这些榜样给了生物黑客一些底气，让他们可以嘲笑专业主义的虚伪和专家崇拜。信息技术领域中的非专业研究者成为变革者，现在由他们来定义自己领域的“专业”了，因为他们的想法成功了。今后最牛的生物技术很有可能就诞生在邻居家的车库里，“车库传奇”将在生物界继续它的旅程。

生物黑客的目标是把生物技术带出实验室，打破常规实验室的限制，在不同环境下创新发展生物技术。生物黑客们在网上教人们如何从菠萝里提取基因，还教人们如何以低廉价格从水、酒精中提取基因，甚至告诉人们如何网购低价的实验仪器，并利用这些仪器进行从简单到复杂的基因工程。加入“生物黑客”团体很容易，只要你家里车库能腾出足够大的空地方，然后再摆上生物仪器，开始做生物实验，那么你就是其中一员了。生物工程成本的日益下降和大众对生物学自发的喜爱之情，催生了这类特殊的黑客团体。基因克隆和基因排序曾经需要花3年时间，整个过程足以让研究者获得博士学位。而随着研究手段发展，完成这样的任务缩短至不到3天。如今，网上能买到用于放大DNA的机器以及用于制造、控制和粘合DNA的化学制剂。2001年，读取100万个DNA碱基对的费用大约10万美元，如今只需约10美分。

生物学家埃伦·约尔延森2010年在哈佛医学院著名基因学家乔治·丘奇等专业人士支持下，在纽约布鲁克林建立“基因空间”生物黑客实验室。无论是初级爱好者还是资深发烧友，都可以使用这个实验室的先进设备，并得到专家指导，每月付100美元即可。约尔延森给实验室拟定的口号是“记住玩科学的时光”。她说，她创立这个实验室是为了让生物黑客单纯凭兴趣研究生物，而不用受经济条件限制，也不用考虑研究结果是否有医学价值。“人们怀着对科学的热情自愿来做研究，而不是为了谋生。”一家名为“生物好奇者”的俱乐部2011年在硅谷成立，马萨诸塞州成立了“波士顿开放资源科学实验室”，名为BUGSS的生物黑客俱乐部最近在巴尔的摩诞生。许多生物黑客致力于开发价廉物美的实验用具。“波士顿开放资源科学实验室”创建人马克·考埃尔打算推出供初级生物研究爱好者使用的套装实验用具。

美国麻省理工学院生物工程毕业生凯·奥尔在美国生物黑客圈小有名气。她花500美元采购实验用品和设备，把它们安装在卧室壁橱里，建成一个迷你实验室。父亲被诊断出患血色病后，奥尔决定用基因检测方法看自己是否会遗传这种身体无法排出多余铁元素的病。一般来说，女性50岁以前不会出现血色病症状，奥尔自我检测时22岁。商业检测一个人是否携带血色病基因并不新鲜，但奥尔想DIY(自己动手)，证明看似复杂的检测在简易实验室里也能实施。奥尔的检测显示，她从父亲那里遗传血色病基因，从母亲那里遗传正常基因，意味着她携带患病基因，但不会患病。

31岁的美国计算机工程师梅瑞蒂丝·帕特森，在自家的餐厅里成功改良了优格菌——酸奶里的一类菌种。这种经过改良的优格菌，遇到三聚氰胺——毒奶粉中的有害物质就会泛绿光，发出警示。3名德国科普作家在办公室里开辟了一块“生物试验田”。他们在网上购买了分离DNA的离心分离机、能照亮DNA碎片的灯箱、能给微量物质称重的仪器和一些消毒仪器等，然后，他们从海鲜店买来生鱼片作为研究材料。经过几个月的努力，他们提取了生鱼片中一种名为COX1的基因。之后，他们又成功地发现了一种对运动有益的特殊基因。最牛的是一家农业生物技术公司，它是从一个地下室发展起来的，后来逐步走上正轨。这家公司转手的时候，卖出了几个亿的价钱。

Sosa是加州San Jose的一个IT顾问，3年前一天他希望培养出一个器官，此后生物黑客成为他的业余爱好。开始他不知道如何实现自己的想法，只以为就是培养干细胞就可以办了。操作细胞的挑战促使他开始认真阅读分子生物学教材，参加一些讲座，自学一些实验技术。他参加了加州森尼维耳市的BioCurious社区实验室。虽然没有经过系统正规的科学研究训练，Johan Sosa仍然十年如一日地热衷于各种最强大的分子生物学技术。他是一个典型的生物黑客，现在他已经开始使用最新最潮的基因编辑工具CRISPR，这个工具面世才3年，能对目标DNA进行编辑。他现在已经掌握到体外编辑基因的程度，他希望用这个技术对酵母基因进行编辑，让酵母能制作酪蛋白，这种蛋白在牛奶中大量存在，这样或许能用酵母直接制造出素食奶酪（思路似乎不错）。这一思路让他学习并掌握了酵母制造蛋白质需要进行化学修饰的过程。他现在已经掌握了一些大型著名实验室掌握的实验技术，每次想到这一点都让他十分兴奋。

CRISPR属于傻瓜型基因编辑工具，不仅简单，而且通用。让科学家第一次拥有随意编辑特定基因的流行工具。利用这种技术，三年来科学家已经成功对细菌到人类等不同类型的细胞进行基因编辑，甚至都引起了许多担心人类基因被编辑带来无法收拾后果的人的强烈担心，专门搞一些活动抵制这种编辑人类基因的活动。科学家利用这种技术，作为尝试进行消除遗传性贫血的基因治疗，治疗恶性肿瘤和生长人体器官的猪。甚至有人提出修改大象基因组，复原早已灭绝的猛犸象的设想。CRISPR的特征非常适合生物黑客要求技术能DIY的胃口，越来越多社区业余生物学家在自己家庭实验室开始进军CRISPR。天然的创新精神激发他们利用这种技术编辑酵母基因，寻找能改变啤酒味道的菌种，构建艺术品和更基础的科学问题。都柏林生物黑客和企业家Andreas Stürmer说，CRISPR是有史以来最了不起的工具，可以在自己的家里玩。

关于CRISPR技术，最大的担忧之一是通过基因改造制造出致病能力更强的超级病原体。当今用于读取和编写DNA的技术前景最辉煌，同时也让人们担心，有人会在厨房里面合成出微小的超级病菌，并且直到恶果无法挽回，人们都还看不见它们。也许，任何人能从网上查到流感病毒的遗传密码就是超级病菌诞生前的序幕。一旦科学家能在最初猪流感爆发后的短时间内分离出病毒，对病原生物进行基因组测序便是小菜一碟。不久之后，通过从零开始编写代码创造新病毒会变得非常简单。把这个代码给任何有要求的人，一下子就使遥不可及的事情变成了一条同时通向毁灭与革新的路。正如猪流感和接踵而来的恐慌所展示的那样，生物黑客也许能够通过利用人群传播传染病将恶意最大化。

美国国家生物安全科学咨询委员会委员迈克尔·奥斯特霍姆担心，业余爱好研究生命奥秘的人或许会把自制某种致命病毒看做个人挑战。美国联邦调查局同样有这种担心，为跟踪DIY式生物研究进展，成立“生物对策室”，隶属联邦调查局防止大规模杀伤性武器扩散司。“生物对策室”密切跟踪生物黑客动向，2012年6月组织首届国际生物黑客研讨会，邀请来自世界各国的生物黑客(包括三名德国作家)到加利福尼亚州沃尔纳特克里克聚会，希望生物黑客们协助“生物对策室”防止生物技术用于恐怖行动。学微生物出身的“生物对策室”主任纳撒尼尔·黑德在研讨会上说：“我们希望了解生物黑客行为，区分好黑客和坏黑客。”联邦调查局希望生物黑客们相互监督，做抵御“邪恶人物”的“第一道防线”。联邦调查局一名女发言人说，眼下尚未监督或调查哪个生物黑客实验室。

一些学者怀疑是否有必要担心生物黑客的作用。哈佛大学个人染色体项目主任、“生物DIY”网站创始人之一贾森·博贝说：“有合适的厨具未必能成大厨，认为专业实验室做的一切都能在家里做是一种误解。”威尔逊中心（WilsonCenter，华盛顿特区的一个智囊团）研究科学政策的托德·奎肯（Todd Kuiken）表示，这些担忧也许是多此一举。他说，大多数生物黑客是出于善意，例如制造五颜六色的细菌或者酿造独特的啤酒。奎肯补充道，也有些人高估了一般DIY生物学家的能力。酶和抗体之类的试剂价格昂贵，分子生物学实验耗费时间，而专业科学家能用的设备往往是个人或社区实验室所无法企及的。大多数社区实验室坚持要求其成员操作的有机体只需最低级别的生物安全防护措施，这样就排除了人体细胞和大多数病原体。在欧洲某些地区，遗传工程在专业场合之外是非法的。

支持生物技术“车库化”的人称，生物技术很重要，决不能被少数人垄断。他们的观点是，官僚主义让最新生物技术的推广过程变得十分繁琐，这会延长解决问题的时间，不利于问题的解决。与此同时，那些权力欲望特别强烈的官僚主义者，很可能也会因为利益驱动放弃一些有效解决问题的新技术。实际上，“生物黑客”所具备的危险性是生物技术本身的特点造成的，像所有强大的技术一样，生物技术也是一把双刃剑。解决这个问题的关键，是看将生物技术交给更多的人（即生物技术“平民化”）之后，得到的更多还是失去的更多。

CRISPR简史

1987年12月，研究者发现大肠杆菌中的CRISPR序列，但并未鉴定其功能。

1995年7月，研究者在其他微生物中发现CRISPR普遍存在。

2007年3月，丹尼克斯食品公司的科学家证实该重复序列属于细菌防御病毒的系统。

2012年6月，研究者利用CRISPR靶向特定的DNA序列，证实其基因编辑的潜力。

2013年1月，CRISPR被用于小鼠和人类细胞，促进了该技术的迅速应用。

2013年3月，加州大学及其他机构为其发现申请了专利。

2014年4月，麻省理工学院以及布罗德研究所通过了CRISPR基因编辑的专利，点燃了激烈的专利大战。

2015年3月，第一项CRISPR基因驱动发布，可以在一个种群中迅速传播被编辑的基因。

2015年4月，研究者报道了利用CRISPR对人类胚胎的基因编辑，导致伦理辩论。